Produção de ácido mucônico a partir de glicose e xilose em Pseudomonas putida via evolução e engenharia metabólica

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 4925 (2022) Citar este artigo

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O ácido mucônico é uma molécula bioprivilegiada que pode ser convertida em produtos químicos de substituição direta para petroquímicos tradicionais e bioprodutos com desempenho vantajoso. Neste estudo, Pseudomonas putida KT2440 é projetada para converter glicose e xilose, os carboidratos primários em hidrolisados ​​lignocelulósicos, em ácido mucônico usando uma estratégia guiada por modelo para maximizar o rendimento teórico. Usando evolução laboratorial adaptativa (ALE) e engenharia metabólica em uma cepa projetada para expressar a via D-xilose isomerase, demonstramos que mutações no simportador heterólogo D-xilose:H+ (XylE) aumentaram a expressão de um transportador facilitador principal da superfamília (PP_2569 ) e a superexpressão de aroB que codifica a 3-desidroquinato sintase nativa permite a produção eficiente de ácido mucônico a partir de glicose e xilose simultaneamente. Usando a cepa manipulada racionalmente, produzimos 33,7 g L-1 de muconato a 0,18 g L-1 h-1 e um rendimento molar de 46% (92% do rendimento teórico máximo). Essa estratégia de engenharia é promissora para a produção de outros compostos derivados da via do chiquimato a partir de açúcares lignocelulósicos.

O desenvolvimento de processos econômicos para a produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir da lignocelulose será fundamental para ajudar a reduzir as emissões antrópicas de gases de efeito estufa associadas ao consumo de combustíveis fósseis1,2. Entre as várias áreas do espaço metabólico que têm sido exploradas para a produção bioquímica, as moléculas das vias catabólicas aromáticas microbianas exibem uma diversidade química substancial3,4. Digno de nota, o ácido cis, cis-mucônico (doravante muconato) é uma plataforma química popular da via catabólica do catecol que pode ser produzida a partir de compostos aromáticos derivados de lignina, carboidratos e compostos aromáticos derivados de resíduos de plásticos5,6,7,8,9 ,10,11,12. Muconato é uma molécula bioprivilegiada13 que pode ser convertida em produtos químicos de substituição direta, como ácido adípico e ácido tereftálico5,14,15, ou convertida em bioprodutos com desempenho vantajoso16,17,18,19,20,21,22,23,24 .

A produção de muconato a partir de carboidratos é baseada na via do chiquimato para a biossíntese de aminoácidos aromáticos e foi demonstrada pela primeira vez em Escherichia coli recombinante5. Eritrose-4-fosfato (E4P) e fosfoenolpiruvato (PEP) são condensados ​​para formar 3-desoxi-d-arabinoheptulosonato 7-fosfato (DAHP), que é posteriormente convertido em 3-desidroshiquimato (3-DHS), um intermediário chave na via do chiquimato. A partir do 3-DHS, pelo menos cinco vias foram relatadas para a biossíntese de muconatos25,26,27,28,29,30. Entre essas vias, uma passa pelo protocatecuato intermediário (PCA) via uma 3-DHS desidratase (asbF) e resulta em um rendimento teórico máximo maior do que as outras, que passam pelo chiquimato via uma chiquimato desidrogenase (aroE) (Fig. 1a )29.

um esquema da estratégia geral de engenharia metabólica. Para utilizar xilose, xilE, d-xilose isomerase (xilA), xiluloquinase (xilB), transaldolase (tal) e transcetolase (tkt) de E. coli foram expressos de forma heteróloga. E4P e PEP foram condensados ​​para formar DAHP por meio de uma DAHP sintase resistente a feedback (aroGD146N)70. Para converter DAHP em muconato (MA), os genes que codificam uma 3-DHS desidratase (asbF) de Bacillus cereus e uma PCA descarboxilase (aroY) e sua correspondente proteína geradora de cofatores (ecdB), ambos de Enterobacter cloacae, foram heterólogamente expresso. aroB e catecol 1,2-dioxigenase (catA) foram superexpressos3,32. Um piruvato-liase de corismato modificado de E. coli (ubiC-C22)40 foi superexpresso para converter corismato (CSA) em 4-hidroxibenzoato (4HB), que pode ser convertido em PCA e MA. Genes deletados são mostrados em vermelho. A glicose desidrogenase (gcd) foi deletada para prevenir a formação de xilonato ou gluconato. As isomerases de glicose-6-fosfato pgi-1 e pgi-2 foram deletadas anteriormente3,32, mas pgi-1 foi restaurada neste estudo. As piruvato quinases pykA e pykF foram deletadas para reduzir a competição por PEP. Para acumular MA, pcaHG e catBC foram excluídos para prevenir a abertura do anel de PCA e o catabolismo de MA, respectivamente. P fosfato, 2-KGn 2-cetogluconato, 2-KG-6-P 2-cetogluconato-6-P, G6P glicose-6-P, 6PG 6-fosfogluconato, KDPG 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, G3P gliceraldeído-3-P, FBP frutose-1,6-P2, F6P frutose-6-P, S7P sedoheptulose-7-P, R5P ribose-5-P, Ri5P ribulose-5-P, 3PG 3-fosfoglicerato, CAT catecol, SA chiquimato, S3P chiquimato-3-fosfato, ICIT isocitrato, CIT citrato, AKG alfa-cetoglutarato, SUCC succinato, FUM fumarato, MAL malato, GLX glioxilato, OAA oxaloacetato, AcCoA acetil-Coenzima A. b Modelagem metabólica do máximo teores teóricos molares de muconate e carbono com ou sem pgi-1. As linhas azuis representam a via asbF, as linhas vermelhas representam a via aroE, as linhas contínuas representam % de rendimento molar e as linhas tracejadas representam % de rendimento de carbono. As áreas cinzas representam a porcentagem molar de xilose consumida de 33 a 40% (com a glicose restante), mimetizando a composição dos hidrolisados ​​de palha de milho. c Culturas em frasco agitado da cepa QP328 em glicose e xilose. % de rendimento molar foi calculado como [mM muconate/mM (glicose + xilose) × 100], e % rendimento de carbono foi calculado como [mM muconate × 6/mM (glicose × 6 + xilose × 5) × 100]. As barras de erro representam o desvio padrão de triplicados biológicos. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.